Pokročilé technologie v ICP-MS pro překonávání interferencí při mapování distribuce prvků v biologických vzorcích pomocí LA-ICP-MS – iCAP TQ

28.09.2017

Úvod

V oblasti "life science" studií stále vzrůstá počet publikovaných prací, které jsou soustředěny na techniky umožňující zobrazování prostorové distribuce prvků. Pro stopové a ultrastopové mapování prvků je vhodnou technikou laserová ablace ve spojení s hmotnostní spektrometrií indukčně vázaného plazmatu (LA-ICP-MS), která se vyznačuje vysokou citlivostí, širokým lineárním rozsahem a možností stanovení přesné kvantity. Obecně se metoda ICP-MS může potýkat s řadou izobarických a polyatomických interferencí, které mohou vést k falešně pozitivním výsledkům. U metody LA-ICP-MS, kdy je doba trvání signálu velmi krátká, se interference ještě obtížněji predikují. 

ICP-MS s trojitým kvadrupólem (iCAP TQ ICP-MS, Thermo Scientific) umožňuje použití specifické selektivní reakce, která způsobí posun hmoty analytu nebo interferentu ("mass shift"), a tak usnadňuje analýzu složitěji měřitelných prvků jako je železo, selen, fosfor a další.  Obrovský přínos má toto řešení interferencí právě v zobrazování distribuce prvků v biologických vzorcích, které jsou často v podobě velmi tenkých řezů a vyžadují stanovení s dobrým prostorovým rozlišením. Množství vzorku, které je po interakci s laserovým pulsem neseno do ICP je tak velmi malé. 

Obr. 1: LA-ICP-MS: Thermo Scientific iCAP TQ ICP-MS + laserový ablační systém CETAC Technologies LSX-213 G2+. 

Instrumentace

Pro analýzu CETAC Technologies LSX-213 G2+ byl připojen k iCAP TQ ICP-MS. Pro zajištění detekce i velmi malých koncentrací prvků při malém množství ablatovaného vzorku byla u ICP-MS použita konfigurace pro vysokou sensitivitu. Parametry jsou uvedeny v Tab. 1.

Obr. 2: Parametry přístrojovéhovybavení LA-ICP-MS.

Před samotnou analýzou byly pomocí softwaru Qtegra Intelligent Scientific Data Solution (ISDS) automaticky nastaveny parametry pro plazma i rozhraní a plně přizpůsobeny pro měření s laserovou ablací. Byly použity tři módy měření:

SQ-O₂ – jednoduchý kvadrupól s kolizně reakční celou (CRC – collision/reaction cell) natlakovanou kyslíkem jako reakčním plynem.

SQ-KED – jednoduchý kvadrupól s CRC natlakovanou heliem jako kolizním plynem v módu diskriminace kinetickou energií (KED – kinetic energy discrimination)

TQ-O₂ – trojitý kvadrupól s CRC natlakovanou kyslíkem jako reakčním plynem, první kvadrupól (Q1) nataven na hmotu analytu (M⁺) a třetí kvadrupól (Q3) nastaven na hmotu produktu reakce analytu s kyslíkem (MO⁺)

Příprava vzorku

Stonky a listové řapíky tabáku byly zmrazeny v médiu hydroxyethyl celulóza (médium s nízkým obsahem Ca) a řezány pomocí kryostatu na řezy o tloušťce 30 µm. Řezy byly následně přeneseny na křemenná sklíčka (také s nižším obsahem Ca než běžná borosilikátová skla).

Ledviny krysy byly řezány v médiu Technovit® na řezy o tloušťce 5 µm a přeneseny na běžná sklíčka.

Játra krysy byly zmrazeny a pomocí kryostatu byly vyhotoveny řezy o tloušťce 5 µm a přeneseny rovněž na běžná sklíčka.

Výsledky – srovnání SQ-O₂ a TQ-O₂ při mapování distribuce P, S a Ca v příčném řezu řapíků tabáku

Pro rostlinné vzorky jako je tabák (Nicotiana tabacum) jsou pro stanovení významné hlavně nutriční prvky, jako je např. Ca. Vápník hraje důležitou roli v obranných mechanismech rostliny, při jejím hojení poškozených pletiv a má významnou funkci při přenosu signálů u eukaryotických buněk. Změny v distribuci během různých stádií růstu rostliny, nebo také rozdíly v distribuci Ca mezi přírodními a geneticky upravenými rostlinami, mohou být důležité informace objasňující zmíněné mechanismy. I když LA-ICP-MS je velmi užitečný nástroj pro mapování prvků v biologických materiálech, analýza vápníku pomocí jednoduchého kvadrupólu (SQ-ICP-MS) je znesnadněná interferencemi s nosným i kolizním plynem (např. ⁴⁰Ar⁺ a ⁴⁰Ca⁺, ⁴⁰Ar⁴ He⁺ a ⁴⁴Ca⁺) a také interferencemi s matričními prvky (např. ³⁹K¹ H⁺ a ⁴⁰Ca⁺).

Fosfor a síra jsou často používanými prvky pro vizualizaci mnoha biologických vzorků, jelikož jsou přítomny ve všech buňkách a poskytují jasnou strukturní informaci. I zde jsou při použití SQ-ICP-MS problémové interference jako např. ¹⁶O¹⁶O⁺ a ³²S⁺.

Pro porovnání výsledků jednoduchého a trojitého kvadrupólu byly analyzovány vzorky řapíku tabáku (Obr. 1) pomocí módu SQ-O₂   (pravá polovina řapíku – Obr. 2) a móduTQ-O₂ (levá polovina řapíku – Obr. 3). K eliminaci interferencí byl u obou módů použit kyslík jako reakční plyn, což vede k posunu hmoty (mass shift) u všech tří analytů: ³¹P → ³¹P¹⁶O, ³²S → ³²S¹⁶O, ⁴⁴Ca → ⁴⁴Ca¹⁶O.

Obr. 3: Příčný řez řapíkem listu tabáku.

Obr. 4: Mapy distribuce prvků v příčném řezu řapíku listu tabáku získané pomocí LA-ICP-MS v módu SQ-O₂ – vlevo ³¹P¹⁶O, uprostřed ³²S¹⁶O a vpravo ⁴⁴Ca¹⁶O.

Obr. 5: Mapy distribuce prvků v příčném řezu řapíku listu tabáku získané pomocí LA-ICP-MS v módu TQ-O₂ – vlevo ³¹P¹⁶O, uprostřed ³²S¹⁶O a vpravo ⁴⁴Ca¹⁶O.

Jak je patrné z Obr. 4 a Obr. 5, reakce vedoucí k posunu hmoty úspěšně odstranila většinu interferencí pro P a S v módu SQ i TQ. Struktura příčného řezu řapíkem je jasné oddělená od pozadí. Lze také pozorovat vysoký obsah P v použitém médiu při řezání, což je patrné u obou módů. 

Pro Ca posun není posun hmoty reakcí s kyslíkem dostačující pro efektivní odstranění interferencí, což se projevilo neostrým obrazem řapíku při použití SQ módu, kde jsou viditelné jen některé výraznější body. Tyto body odpovídají idioblastům, tedy specializovaným buňkám, které akumulují šťavelan vápenatý jako obrana proti býložravcům.  Naproti tomu za použití módu TQ lze vápník úspěšně mapovat na celé ploše vzorku, včetně trichomů a jemných struktur.

Výsledky - srovnání SQ-O₂ a TQ-O₂ při mapování distribuce Fe a Se v řezech ledvinou a játry krysy

Pro tenké řezy živočišných tkání je stanovení prostorové distribuce i více prvků naráz velmi žádaná. LA-ICP-MS  je tedy výborným kompromisem mezi počtem analytů, které je možno měřit najednou, a citlivostí a prostorovým rozlišením.  Podobně jako u rostlinných vzorků je mnoho prvků zatíženo interferencemi jako např. železo (⁴⁰Ar¹⁶O⁺ a ⁵⁶Fe⁺) nebo selen (⁴⁰Ar⁴⁰Ar⁺ a ⁸⁰Se⁺). 

Pro srovnání obou módu, tedy jednoduchého a trojitého kvadrupólu, byly připraveny dva paralelní tenké řezy ledvinou krysy, které byly analyzovány jednak v módu SQ-O₂ (Obr. 6, Obr. 7) a TQ-O₂ (Obr. 8, Obr. 9). Jako reakční plyn byl zvolen kyslík. Stejně byly analyzovány také játra krysy (Obr. 10).

Obr. 6: Mikroskopické obrázky tenkých řezů ledvinou krysy pořízené metodou fluorescence (vlevo) a metdou ve světlém poli (vpravo) pro analýzy v SQ-O₂ módu.

Obr. 7: Mapy prostorové distribuce ⁵⁷Fe (vlevo) a ⁷⁷Se¹⁶O (vpravo) pro SQ-O₂ mód.

Obr. 8: Mikroskopické obrázky tenkých řezů ledvinou krysy pořízené metodou fluorescence (vlevo) a metdou ve světlém poli (vpravo) pro analýzy v TQ-O₂ módu.

Obr. 9:  Mapy prostorové distribuce ⁵⁷Fe (vlevo) a ⁷⁷Se¹⁶O (vpravo) pro TQ-O₂ mód.

Na obr. 7 je patrná schopnost mapovat distribuci Fe a Se v módu SQ-O₂ . Pro ⁵⁷Fe (Obr. 7 vlevo), je však intenzita pozadí příliš vysoká díky přítomným interferentům ⁴⁰Ar¹⁶O¹ H a ⁴⁰Ar¹⁷O v kolizní cele, což znesnadňuje odlišení vzorku od pozadí. U ⁷⁷Se¹⁶O (Obr. 5 vpravo) je sice pozadí blízké nule, avšak intenzity izotopu Se o m/z 77 jsou příliš nízké pro vizualizaci. Hlavní izotop m/z 80 (zde neukázáno) dává ještě horší výsledky díky silné interferenci Ar navzdory posunu hmot a tvorby ⁹⁶Ar₂O z iontů ⁴⁰Ar⁺ and ⁴⁰Ar¹⁶O⁺.

Naproti tomu výsledky za použití TQ-O₂ módu ukazují jasné mapy distribuce Fe i Se (Obr. 7). Při měření ⁵⁷Fe (Obr. 7 vlevo) se na prvním kvadrupólu (Q1) odstranily prekurzor iontů Ar⁺, který tak dále nemohl reagovat s kyslíkem v reakční cele, a došlo tak k výraznému snížení intenzit pozadí a jasnému vykreslení detailní mapy distribuce Fe. U ⁸⁰Se¹⁶O (Obr. 7 vpravo) jsou intenzity stále relativně nízké díky malému množství Se přítomnému ve vzorku. Díky TQ-O₂ módu však byly odstraněny prekursor iontů na bázi argonu a navíc byla znemožněna oxidace dimeru ⁸⁰Ar² a tak byly efektivně odstraněny nežádoucí interference na této m/z. Hlavní izotop Se o m/z 80 po posunu hmoty na m/z 96 umožňuje mapování distribuce Se ve vzorcích i s velmi nízkým obsahem tohoto prvku.

Obr. 10: Mikroskopické obrázky tenkých řezů jater krysy pořízené metodou fluorescence (vlevo) a metdou ve světlém poli (vpravo) pro analýzy v módu KED (vlevo) a v TQ-O₂ módu.

Obr. 11: Mapy prostorové distribuce ²³Na (vlevo) a ⁵⁷Fe (vpravo) pro SQ-KED mód.

Obr. 12: Mapy prostorové distribuce ²³Na (vlevo) a ⁵⁶Fe¹⁶O (vpravo) pro TQ-O₂ mód.

Mapy distribuce prvků jsou viditelné u obou módů, SQ-KED (Obr. 9 vlevo) i TQ-O ₂ mód (Obr. 10 vlevo). Sodík není příliš zatížen interferencemi, což se projevuje zejména tím, že přidání dalšího kvadrupólu v módu TQ-O ₂ nezpůsobilo výrazné zeslabení citlivosti, jak by se očekávalo (maximum 4,5.10⁶ v SQ-KED módu vs. 4,0.10⁶ v módu TQ-O₂ ). 

Také distribuce Fe pozorovaná pomocí SQ-KED (Obr. 10 vlevo) módu a TQ-O₂ módu je podobná (Obr. 10 vpravo). Nicméně SQ-KED mód umožňuje eliminaci interferencí pouze u izotop ⁵⁷Fe, zatímco v módu TQ-O₂ lze měřit hlavní izotop o m/z 56 (posunutý na m/z 72). To vede k výrazně vyšší citlivosti v TQ-O₂ (7,0.10³ v SQ-KED módu vs. 7,0.10⁴ v módu TQ-O₂ ). 

Závěr

Technologie s trojitým kvadrupólem iCAP TQ ICP-MS   jednoduše a s vynikající reprodukovatelností eliminuje spektrální interference na klíčových analytech (P, S, Ca, Se, Fe) při mapování distribuce prvků v biologických materiálech. 

Zdroj:

Aplikační poznámka Thermo Scientific – AN-43358, ke stažení zde.

Autoři:

Georgina M. Thyssen¹ , Michael Sperling^1,2, Uwe Karst¹, Christoph A. Wehe³, Julian D. Wills³

¹ Institute of Inorganic and Analytical Chemistry, University of Münster, Corrensstr. 28/30, 48149 Münster, Germany

² European Virtual Institute for Speciation Analysis, Mendelstr. 11, 48149 Münster, German

³ Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Straße 11, 28199 Bremen, Germany