16. 3. 2021

V minulém díle jsme pojednávali způsobu detekce a jaké detektory jsou možné pro nový STELLARIS systém. V tomto díle se budeme věnovat akusticko optickému prvku AOBS a laserům, které je možné připojit do systému.

Více signálu = kvalitní výsledky

Přepracovaný programovatelný krystal s názvem AOBS2 (Acousto Optical Beamsplitter) je výraznou inovací v celé konfokální hlavě. Tento krystal řízený akustickým signálem je možné použít pro navázání speciálního pulzního laserového bílého zdroje světla. Díky vlastnostem krystalu s přiloženým akustickým signálem, lze uvnitř vytvořit takové vlastnosti, aby bylo možné přes jeden tento prvek navázat několik laserových vlnových délek současně. Číselně vyjádřeno je možné navázat až 8 vlnových délek. Optický krystal je vysoce transparentní, s výjimečnými vlastnostmi i v emisní části, a to je pro získávání emitovaného signálu kritická část. Na obr. 1 je uvedeno srovnání klasických dichroických zrcadel s AOBS.

Obr. 1 – Srovnání dichroických zrcadel a AOBS

Dichroická zrcadla mají velkou mezeru v emisním spektru, díky nedokonalé výrobě filtrů všeobecně. Díky větší mezeře je pak získávaný signál odfiltrován a tím celkově snížen. U AOBS prvku jsou tyto mezery v emisním spektru opravdu malé a signálu je pak více. Celkově pak lze použít nižších intenzit u použitých laserů a tím snížit vysvěcování preparátů (photodamage, bleaching – nežádoucí jev).

Z aplikačního pohledu je pak výhodou použití AOBS možnost vyhnout se sekvenčnímu snímání několika kanálů, včetně použití super-rezolučního modulu apod., eliminace cross-talk neboli překryv fluorescenčního signálu z jednoho fluoroforu do druhého a v neposlední řadě vyšší propustnost tohoto prvku než přes dichroická zrcadla. Nový AOBS2 dokáže plně odfiltrovat i signál, který přichází přímo do detektoru. Cross-talk lze v systému STELLARIS řešit opravdu mnoho způsoby. STELLARIS umí hardwarové nastavit a oddělit spektra pomocí detektorů a jejich konstrukci. Velkou novinkou jsou pak TauSENCE kontrasty, o kterých budeme psát v dalším díle, který si nenechte ujít. Na obr. 2 jsou zobrazeny živé HeLa buňky značené čtyřmi různými fluorofory k identifikaci jader, aktinu, tubulinu a plazmatické membrány. Nastavením systému STELLARIS je možné všechny 4 kanály nasnímat najednou s nastavením každého detektoru specificky pro získání nejlepšího dynamického poměru.

Obr. 2 – ukázka jednoduchého snímání bez použití sekvenčního snímání pro HeLa buňky a čtyři fluorescenční značky najednou

Bílý laser a další laserové zdroje

Vzhledem k dnešním složitým výzkumným otázkám vědci potřebují systémy, které jsou velmi intuitivní, spolehlivé, orientované pro široké spektrum použití. Systémy by měli nabízet především jednoduché použití bez nutnosti znát dokonale všechny vlastnosti zapojení systému apod. Výsledkem by měla být důležitá biologická či jiná informace, která posune výzkum zase o krůček dál. Další vývoj směřuje k vícebarevným experimentům, rychlejšímu snímání a vyšší flexibilitě systému.

Zpět k laserovým zdrojům, těch může být celá řada. Jak jsou do tradičních systému implementovány hraje velkou roli a velmi se řeší celková propustnost a použití jednotlivých systémů. Diskrétní lasery omezují vaši flexibilitu při výběru jednotlivých fluoroforů především z pohledu nepřesného nastavení laseru do excitačního maxima daného fluoroforu. To znamená vyšší nastavenou intenzitu laserů pro exctitaci fluoroforu a tím vyšší toxicita vzorků. Technologie nové generace laseru s bílým světlem (WLL2), ve spojení s rodinou detektorů Power HyD vám umožní optimálně zobrazovat prakticky jakýkoli fluorofor v dostupném spektrálním rozsahu. Jaký je ten rozsah? Obrovský. Pro systém STELLARIS 5 je možné použít pulzní bílý laser s rozsahem vlnových délek od 485 až 685 nm, s možností volby jednotlivé vlnové délky po 1nm. U systému STELLARIS 8 je potom bílý laser s rozsahem vlnových délek od 440 až 790 nm opět s možností volby po 1nm. Přičtěte si také možnost použití klasických laserových zdrojů do systému. Tím se Vám nabízí obrovské možnosti použití pro všechny konfokální aplikace. Sečteno a podtrženo STELLARIS 5 200 vl. délek a STELLARIS 8 až 350 vl. délek pro excitaci + klasické laserové zdroje uvedené na obr. 3. Zajímá Vás životnost bílého laseru? Bílý laser je vyvíjen ve spolupráci s firmou NKT, některé dlouhodobé testy uvádí více jak desítky tisíc hodin. Výkon bílého laseru postačí na 99 % aplikací, výkon je definován na jednotlivé laserové čáry a tím se opět otvírají další možnosti v použití pro FRAP experimenty apod.

Obr. 3 – Možnost použití laserových zdrojů pro systémy STELLARIS

Oblast NIR s bílým laserem až do 850nm

Většina konvenčních konfokálních systémů je vybavena pouze jednou nebo dvěma samostatnými laserovými linkami v červené NIR oblasti. Kromě toho konvenční GaAsP detektory nejsou dostatečně citlivé v rozsahu pro NIR oblast. Oba tyto faktory výrazně omezují počet červených barviv, které lze zobrazit v jediném experimentu. Trend poslední doby ukazuje posun do NIR oblasti, kde jsou barviva stabilnější a méně náchylná na phototoxicitu. Ukázka na obr. 4 s buňkami Cos-7 značené červeně excitovatelnými sondami specifické pro aktin, mitochondriální vnější membránu a tubulin. Tradiční konfokální mikroskopie s detektorem GaAsP detekuje pouze SiRActin. Při použití rozšířeného WLL2 na STELLARIS 8 společně s detektorem HyD R je tedy možné snímat i v oblasti NIR až do 850 nm!

Obr. 4 – aplikační ukázka pro fluorescenční značení do NIR oblasti

Kde se lasery připojují?

Připojení laserů ve skenovací hlavě je uvedeno na obr. 5, který jste již mohli vidět v předchozím díle seriálu o STELLARIS. Důležitá část pro tento díl je připojení laserových zdrojů v pravé části obrázku. Řízení laserů je po většinou řízeno přes AOTF (Aukusticko optický laditelný filtr), který ovládána nastavení intenzity pro použitý laser či DMOD (direct modulace). Pro systémy s MP laserem je to potom AOM (akusticko optický modulátor). Jaký laser použít závisí na aplikaci. Pokud nevíte, jaký typ laseru byste měli použít, prosím, napište nám, rádi Vám pomůžeme.

Obr. 5 – skenovací jednotka systému STELLARIS8

Co bude v dalším díle?

V dalším díle se zaměříme na technologii detektorů Power HyD S, R, X a novinku pro systémy STELLARIS TauSENSE. Ukážeme si také, jak flexibilní a jednouchý může systém STELLARIS být.

Na něco jsme zapomněli? Něco není správně popsané? Máte jakýkoliv dotaz? Napište nám na: mikroskopie@pragolab.cz